Le document suivant correspond au descriptif du TP de physiologie animale du module de Physiologie générale e tcellulaire de la licence de BCP. Ce TP (enseignement assisté par ordinateur) est consacré à l'étude de l'homéosasie calcique de la cellule musculaire lisse vasculaire, par l'analyse de tracés simulés de réponses calciques à la stimulation par l'endothéline.

Introduction

Principe et déroulement du TP

principe
objectifs
organisation
Rédaction du compte-rendu

Utilisation des fichiers

obtention des données expérimentales
calcul des valeurs
test statistique

Comme toutes les cellules animales, les cellules musculaires lisses mettent en jeu des mécanismes qui maintiennent, contre le gradient électrochimique de calcium entre les milieux extra- et intracellulaire, une [Ca²⁺]_i faible, permettent une élévation rapide de la [Ca²⁺]_i et assurent un retour à une [Ca²⁺]_i basale compatible avec la survie cellulaire. La transduction membranaire du message extracellulaire responsable de la contraction aboutit à l’augmentation de la concentration cytosolique en ions calcium. Comme dans les autres cellules musculaires, c’est la valeur de la [Ca²⁺]_i qui contrôle le fonctionnement de l’appareil contractile. La compréhension du fonctionnement de la cellule musculaire lisse passe donc par l’étude des variations de la [Ca²⁺]_i lors de la stimulation de la cellule par un agoniste contractant. Ceci est possible grâce à l’emploi de sondes fluorescentes sensibles au calcium introduites dans le cytoplasme de la cellule étudiée. Lorsqu’elles sont excitées, ces sondes émettent une lumière dont l’intensité dépend de la liaison de la sonde au calcium. La mesure de l’intensité de la fluorescence émise permet, après calibration, de déterminer la variation de la [Ca²⁺]_i au cours du temps (cf. infra).

Le TP consacré à l’homéostasie calcique consiste à analyser les tracés de mesure des variations de la [Ca²⁺]_i obtenus dans diverses conditions expérimentales, afin de caractériser la réponse calcique, c’est-à-dire de déterminer

• le profil de la réponse ;
• les sources de calcium mobilisées ;

Le TP est un enseignement assisté par ordinateur qui simule l’obtention de tracés expérimentaux obtenus par stimulation de cellules musculaires lisses vasculaires en culture par l’endothéline 1.

Les endothélines sont des polypeptides dont il existe trois formes, les endothélines 1, 2 et 3 (ET-1, ET-2 et ET-3). Ce sont de puissants vasoconstricteurs qui agissent sur la cellule musculaire lisse par l’intermédiaire d’un récepteur membranaire couplé aux protéines G, dont il existe deux sous-types, le récepteur de type A et le récepteur de type B. Ces deux sous-types de récepteurs sont couplés à des protéines G, et peuvent agir sur la [Ca²⁺]_i de deux manières : soit en provoquant la libération de calcium à partir du réticulum sarcoplasmique (RS), soit en induisant un influx de calcium extracellulaire par l’ouverture de canaux calcium présents sur la membrane plasmique.

La libération de calcium intracellulaire peut se faire de 2 façons :

– par l’ouverture des canaux-récepteurs à l’IP₃ (RIP₃) ;

– par l’ouverture de canaux-récepteurs sensibles à la ryanodine (RyR).

Le repompage du calcium dans le RS est assuré par des pompes calciques ATPases du RS, les SERCA.

L’influx de calcium extracellulaire peut se faire de 2 façons :

– par l’ouverture de canaux calcium dépendants du potentiel de type L (ce sont les principaux canaux calciques présents dans la cellule musculaire lisse vasculaire) ;

– par l’ouverture d’autres types de canaux, par exemple des canaux cationiques non spécifiques.

La figure 1 représente les structures potentiellement impliquées dans la réponse de la cellule musculaire lisse à l’endothéline.

Les objectifs des expérimentations sont les suivants :
 

• 1. caractériser qualitativement et quantitativement la réponse calcique à l’endothéline 1, c’est-à-dire décrire les différentes phases de la réponse calcique à l’endothéline, et déterminer les moyennes et les SEM de [Ca²⁺]_i de ces différentes phases.

• 2. identifier la(les) source(s) de calcium impliquée(s) dans la réponse, c’est-à-dire l’influx de calcium extracellulaire et/ou la libération de calcium intracellulaire. On précisera les structures éventuellement impliquées, soit :

• calcium extracellulaire : canaux de type L ou autres types de canaux
• calcium intracellulaire : RIP₃ ou RyR ;

1^re étape :

caractérisation quantitative de la réponse calcique et détermination des sources de calcium impliquées dans cette réponse, à savoir :

• influx de calcium extracellulaire et/ou
• libération de calcium intracellulaire.

détermination des structures impliquées :

• types de canaux membranaires
• types de canaux du RS

• 1. condition contrôle : chaque cellule est stimulée pendant 30 secondes par microéjection d’endothéline (10^-7 M), dans une solution saline physiologique (PSS).

• 2. absence de calcium extracellulaire : chaque cellule est stimulée de la même manière, mais la solution extracellulaire ne contient pas de calcium.

• 3. effet de la thapsigargine : chaque cellule est stimulée de la même manière, mais après incubation préalable durant 10 minutes dans une solution contenant de la thapsigargine (TG). La TG est un inhibiteur irréversible des SERCA, et l’inhibition des SERCA entraîne la vidange en 8 à 12 minutes du calcium contenu dans le RS.

• 4. effet du vérapamil : chaque cellule est stimulée de la même manière, mais en présence de vérapamil (10 µM). Le vérapamil est un inhibiteur des canaux de type L.

• 5. effet de l’héparine : chaque cellule est stimulée de la même manière, mais en présence d’héparine, qui est un inhibiteur des RIP₃. (NB : l’héparine ne traverse pas la membrane plasmique ; pour cette raison, ces expériences sont réalisées sur des cellules préalablement perméabilisées, de façon à ce que l’héparine puisse pénétrer dans la cellule.)

• 6. effet de la tétracaïne : chaque cellule est stimulée de la même manière, mais en présence de tétracaïne (300 µM), qui est un inhibiteur des RRy.

Le TP consiste à analyser des tracés expérimentaux correspondant à ces 6 conditions expérimentales, obtenus et visualisés par informatique par l’utilisation du logiciel Excel. Le TP comprend donc 6 fichiers Excel correspondant à aux 6 conditions expérimentales :

• tpl1 : condition contrôle
• tpl2 : absence de calcium extracellulaire
• tpl3 : effet de la thapsigargine
• tpl4 : effet du vérapamil
• tpl5 : effet de l’héparine
• tpl6 : effet de la tétracaïne

1^re étape

• caractérisation qualitative et quantitative la réponse calcique à l’endothéline 1

Les valeurs des différentes phases de la réponse calcique sont définies par la variation de la [Ca²⁺]_i au-dessus de la ligne de base. Il convient donc de soustraire la valeur de la ligne de base à la valeur absolue mesurée.

En analysant une quinzaine de tracés en condition contrôle (tpl1), on déterminera la moyenne et l’erreur standard à la moyenne (SEM) de la [Ca²⁺]_i de repos, et des différentes phases de la réponse. (pour les définitions et les calculs, se reporter au § correspondant).

• rôle de l’influx de calcium extracellulaire

• rôle de la libération de calcium intracellulaire

2^e étape

• l’implication des canaux de type L

• l’implication des RIP₃ et/ou des RRy

• Introduction :

• Résultats :

• Discussion :

• Conclusion

Le compte-rendu sera remis à la fin de la séance de TP.

La séance de TP sera suivie la semaine suivante d’une autre séance de 2 h au cours de laquelle les résultats obtenus par chaque binôme seront comparés. Chaque binôme devra pouvoir présenter oralement la synthèse des résultats qu’il a obtenus.

• 6 fichiers Excel (tpl1 à tpl6) correspondant aux différentes conditions expérimentales ;
• 1 fichier Excel (analyse) permettant le calcul des moyennes, écarts-types, SEM, et le test t de Student ;
• 1 fichier Word (aide) qui décrit le TP et correspond au document papier.

obtention des données expérimentales

ouverture du fichier voulu (ex : tpl1)

le fichier s’ouvre sur une feuille qui comprend un graphe où figure le tracé expérimental, et une colonne correspondant à la stimulation.

• stimulation

Ceci va lancer la stimulation et un nouveau tracé va apparaître dans le graphe.

• détermination des valeurs de [Ca2+]i

Déterminer les valeurs voulues et les noter sur la feuille de valeurs. Elles correspondent à la valeur absolue.

• stimulation suivante…

• ouverture du fichier " analyse "

se placer dans une feuille " calcul "

• entrée des valeurs expérimentales

La feuille calcule les valeurs relatives du pic et du plateau, c’est-à-dire les valeurs absolues moins la ligne de base, ainsi que les moyennes, écarts-types.

Pour le calcul de la SEM, il ne faut pas oublier d’indiquer le nombre d’expériences effectuées.

NB : dans les colonnes de calcul, ne pas oublier d’effacer le contenu des cellules pour lesquelles il n’y a pas eu de valeur expérimentales rentrées. Sinon, la valeur " 0 " s’affiche pour ces cellules et est prise en compte dans le calcul de la moyenne, de l’écart-type et de la SEM.

Si nécessaire, on réalise un test statistique (test t de Student) pour comparer les moyennes d’une variable dans 2 conditions expérimentales différentes. Pour cela, on ouvre une feuille " test " du fichier " analyse ". On rentre les valeurs correspondantes aux 2 conditions expérimentales A et B. La valeur P du test est calculée et affichée.

Si P<0,05, la différence entre les 2 conditions est considérée comme significative. Dans l’exemple ci-dessus, la différence n’est pas significative

NB : on peut copier des valeurs obtenues dans une feuille " calcul ", mais on doit faire un " collage spécial " (menu " édition ") des  valeurs seules, non des formules.