pour en savoir plus :
C. Dammond & D. Tritsch. Neurobiologie cellulaire, Doin, Paris, 1990.
pour en savoir beauxcoup plus :
L. J. DeFelice. Electrical properties of cells, Plenum Press, New York, 1997.

cellule " attachée " (cell-attached patch)

Dans cette configuration, on mesure le courant entre la pipette et l’électrode de résistance. Les variations de résistance correspondent à l’ouverture des canaux " patchés "*. Si un seul canal est ouvert à la fois, on enregistre alors un courant unitaire.

cellule entière (whole cell clamp)

Le milieu intrapipette dialyse rapidement l’intérieur de la cellule, le volume de la pipette étant de beaucoup supérieur à celui de la cellule ; les milieux ioniques sont donc connus. Le potentiel membranaire est connu. Le courant mesuré est un courant global, somme de ceux qui passent par tous les canaux ouverts de la cellule. On peut enregistrer le courant global d’un seul type de canaux, en bloquant l’ouverture des canaux d’autres types.

On étudie le ou les canaux présents dans un fragment de membrane séparé de la cellule. On peut étudier la fonctionnement d'un canal unique.

configuration outside-out : la face extracellulaire est située à l’extérieur de la pipette. On l’obtient à partir de la configuration cellule entière. C’est la plus difficile à obtenir. On l’utilise lorsqu’on veut changer la composition du milieu extracellulaire (= extrapipette)

Qu’est-ce qui permet de dire que le canal étudié est un canal dépendant du potentiel (voltage-dependent) ?

Plus on dépolarise, plus le canal est ouvert souvent. À –135 mV, le canal est quasiment toujours fermé (on observe sur la trace uniquement deux évènements d’ouverture du canal, très brefs) ; à –55 mV, il est presque toujours ouvert.

D’autre part, on observe, lorsque que le canal est ouvert, une diminution d’amplitude du courant unitaire. Cela est dû au fait que plus on dépolarise, plus le potentiel de membrane (Vm) se rapproche du potentiel d’équilibre de l’ion responsable du courant. Ceci n’est pas spécifique des canaux dépendants du potentiel (= dont l’ouverture dépend du potentiel de membrane) et s’explique par la loi d’Ohm.

En configuration inside-out, le milieu extrapipette correspond au milieu intracellulaire, la partie extrapipette au milieu intracellulaire. Les concentrations ioniques sont proches des concentrations physiologiques.

Composition moyenne des milieux extra- et intracellulaire de Vertébrés :
 

Milieu	Na+	K+	Cl-	Ca2+
Extracellulaire (mM)	14	3	150	1
Intracelllaire (mM)	14	160	14	10-4

 

calculer les potentiels d’équilibre pour chaque ion.

On utilise l’équation de Nernst, qui définit la différence de potentiel pour laquelle les gradients électrique et chimique s’annulent :

E_i – E_e = - (RT/zF)ln ([X^z]_i/[X^z]_e)

pour une température de 29°C,

E_i – E_e = - (60/z)log ([X^z]_i/[X^z]_e) (mV).

D’où :

réalisation de sauts de potentiel d’amplitude et de durée variables, à partir d’un potentiel de maintien (V_H = holding potential)

Tracer la courbe i = f(V).

Le potentiel d’inversion est de 53 mV. Il est proche du potentiel d’inversion de l’ion Na⁺ ; le courant est donc principalement dû au mouvement d’ion Na⁺. Le canal étudié est un canal sodique.

À partir de la courbe iV, déterminer la conductance (g_Na) du canal étudié.

L’intensité du courant dépend de la conductance du canal et de la force électrochimique appliquée selon la loi d’Ohm
U = R x I
(la conductance g, exprimée en Siemens (S) étant égale à l’inverse de la résistance R).

La force électromotrice correspond à la différence entre le potentiel membranaire E_m et le potentiel d'inversion E_inv.

g (E_m - E_inv) = i  = g E_m - g E_inv

g correspond à la pente de la droite i= f(V) ici, g = 20 pS.

Les concentrations intra- et extrapipette en Na⁺ étant égales, la droite iV doit passer par 0, si le canal ne laisse passer que le sodium. Or, la droite ne passe pas par 0 et est légèrement décalée vers E_K ; le canal est donc légèrement perméable au K⁺.

Calculer le rapport des conductances au Na⁺ et au K⁺ (g_Na/g_K).

Le courant total passant par le canal est égal à la somme des courants sodique et potassique.

i = i_Na + i_K = g_Na(V_m – E_Na) ₊ g_K(V_m – E_K)
 

Au potentiel d’inversion Vm, i = o. D’où :

g_Na(E_Na - V_inv) = g_K(V_inv-E_K)

g_Na / g_K = (V_inv-E_K) / (E_Na - V_inv)

Sur les 3 tracés de la figure A, en absence de pronase, on voit qu’après sur phase d’ouverture du canal, il reste à l’état fermé alors que la dépolarisation est maintenue. Cela correspond à un état inactivé, au cours duquel le canal ne se rouvre pas malgré le maintien de la dépolarisation.

Sur les traces B, on voit que la pronase ne modifie pas l’amplitude du courant unitaire. Par contre, le canal garde sa capacité à s’ouvrir sur toute la durée de la dépolarisation. La pronase supprime donc la capacité du canal à s’inactiver.

Pourquoi détermine-t-on la probabilité d’ouverture à l’état stationnaire en présence de pronase ?

La probabilité d’ouverture du canal p_o correspond aux nombre de canaux ouverts sur le nombre de canaux à l’état ouvert et à l’état fermé.

p_o = [O]/([O] + [F])

En pratique, on détermine la probabilité d’ouverture du canal en mesurant la durée cumulée durant laquelle le canal est ouvert sur la durée totale de la dépolarisation. Cela suppose que le canal ne puisse être que dans l’état ouvert ou fermé, et non dans un état inactivé.

Pour les canaux dépendants du potentiel, comme le courant Na⁺ étudié, la courbe p_o = f(Vm) décrit une sigmoïde. Cette courbe sigmoïde définit les caractéristiques de la dépendance vis-à-vis du potentiel.

Il est à noter que les canaux cationiques dont l'ouverture dépend du potentiel sont évolutivement et structurellement reliés. Un canal est formé de quatre sous-unités comprenant chacune 6 domaines transmembraires.

Les propriétés d'inactivation dépendent de la présence d'un domaine de 19 acides aminés sur l'extrémité amino-terminale de chaque sous-unité.

Pour en savoir plus : Molecular Biology of the Cell. Alberts et al, Garlang Publishing Inc. Chap. 11

disponible à la BU de l'Université en traduction française
accessible par chapitre  sur PubMed (ouverture dans une nouvelle fenêtre)

Le courant global s’explique par la sommation des courants individuels. L’ensemble des canaux ne s’ouvrent pas et ne se ferment pas en même temps, ce qui explique l’aspect " lissé " de la courbe globale par rapport à l’aspect " en carré " des courants unitaires. Le point d’amplitude maximale du courant correspond au moment où le plus grand nombre de canaux sont dans l’état ouvert. Le retour progressif à un courant nul est dû à l’inactivation progressive des canaux.

Pourquoi les expériences ont-elles été effectuées en présence de TEA ?

L’enregistrement du courant global correspond à l’enregistrement de l’ensemble des courants passant par les différents types de canaux ioniques, principalement les courants de sodium et de potassium. Le TEA bloque les canaux K⁺, ce qui permet de n’enregistrer que le courant Na⁺.

Déterminer le potentiel d’inversion. Le comparer au potentiel d’équilibre des ions Na+ et K+. Que peut-on en déduire sur la nature du courant ?

Le potentiel d’inversion est égal à –60 mV.

Les potentiels d’équilibre des ions Na+ et K+ sont les suivants, déterminés par l’équation de Nernst :

E_Na = 60 mM E_K = -87 mV

Le potentiel d’inversion V_m est égal au potentiel d’équilibre du Na⁺. Il s’agit donc d’un courant de sodium.

• dépendant d’un agoniste : la probabilité d’ouverture dépend de la liaison d’un agoniste

Le récepteur nicotinique est un exemple-type de ce types de canaux, dont l'ouverture dépend de la liaison à un agoniste. Les principaux canaux de ce type sont donnés dans le tableau suivant :
 
 

Les canaux cationiques sont excitateurs car leur ouverture entraîne un influx de cations et donc une dépolarisation, alors que l'activation des canaux  Cl^- s'oppose à la dépolarisation.
 
 

Quel serait l’aspect d’une courbe IV d’un canal dépendant d’un agoniste, ou mécano sensible ?

Le courant global I est le produit du courant unitaire i, du nombre de canaux N et de la probabilité d’ouverture p_o. I = i.N.p_o

N est une constance ; i dépend du potentiel de manière linéaire.

Pour un canal dépendant du potentiel, p_o décrit, en fonction du potentiel, une sigmoïde. L’aspect de la courbe I(courant global)V résulte de la conjonction de ses deux paramètres, la courbe sigmoïde de p_o et la droite de i.

Pour un canal non dépendant du potentiel, p_o de dépend pas de V. En absence de stimulation (agoniste, variation de pression…), le courant sera nul, quel que soit le potentiel. En présence d’une stimulation, p_o prendra une valeur donnée, dépendante de l’intensité de la stimulation, mais indépendante du potentiel. La courbe IV sera alors une droite.

modélisation du fonctionnement du canal Cl^- dépendant du Ca²⁺ dans les myocytes des voies aériennes.

Comment varie l’intensité du courant en fonction de la concentration cytosolique en calcium ?

L'intensité est nulle lorsque la concentration cytosolique en calcium est proche de la valeur de repos (100 nM), et elle augmente de manière sigmoïdale en fonction de l'élévation de la concentration en Ca²⁺.

Comment varie l’intensité du courant en fonction du potentiel de membrane ? pourquoi ?
L'intensité du courant, pour une valeur de concentration en calcium donnée, varie linéairement en fonction du potentiel. Cela signifie que la probabilité d'ouverture ne dépend pas du potentiel.

Est-il intéressant de faire des courbes IV sur des canaux indépendants du potentiel ?

L’intérêt des courbes IV sur des courants passant par des canaux indépendants du potentiel est de caractériser ces courants, par comparaison du potentiel d’inversion et du potentiel d’équilibre des ions éventuellement responsables du courant.